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鴿子性別檢測(cè)試劑

作者:農(nóng)業(yè)百科時(shí)間:2025-03-14來源:農(nóng)業(yè)氣象站

鴿子性別檢測(cè)試劑

鴿形目性別核酸檢測(cè)試劑盒(帶內(nèi)參,PCR-熒光探針法)

本試劑盒可對(duì)鴿的羽毛、血液及組織等樣品中CHD-W保守基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),進(jìn)而對(duì)鴿的性別進(jìn)行鑒定。通過引入內(nèi)源性內(nèi)參可對(duì)核酸提取和擴(kuò)增過程進(jìn)行監(jiān)測(cè),確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

產(chǎn)品內(nèi)容:

試劑組分

AN2306002-03(100T)

GW反應(yīng)液

1150μL

GW預(yù)混液

1150μL

GW陽性對(duì)照

100μL

陰性對(duì)照

100μL

儲(chǔ)存條件:

-20℃條件下保存,有效期至少12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)操作:

1.樣本制備(樣本制備區(qū))

1.1樣本要求:

羽毛:采集胸部、腹部或腿部羽毛(含羽根部分)不少于5根,切勿使用自然脫落的羽毛。

全血:使用EDTA作為抗凝劑,切勿使用肝素抗凝,要求使用新鮮全血,或在2~8℃不超過7天,或在-20℃條件下保存不超過3個(gè)月,應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。

組織:采取新鮮肌肉或器官組織(盡可能不使用皮或者筋膜等不易處理樣本)不超過100mg,使用200-500μL無菌水制備組織勻漿液,再進(jìn)行后續(xù)樣本制備。

1.2樣本制備:

請(qǐng)參照三獅生物《動(dòng)物基因組DNA快速提取試劑盒(PCR分析用)說明書》(貨號(hào):DP202),或其他符合相關(guān)要求的核酸提取試劑盒/方法,對(duì)處理后的樣品進(jìn)行核酸提取。提取的樣品核酸放置于冰盒中,并盡量及時(shí)進(jìn)行檢測(cè),4℃保存不超過7天或-20℃保存不超過6個(gè)月。

2.配制反應(yīng)體系(加樣區(qū))

2.1 取出試劑盒中各組分,室溫條件下完全解凍,離心10秒,將管壁和管蓋內(nèi)的液體離心至管底;按樣本數(shù)量(n+2)(即n個(gè)待檢樣本+1個(gè)陽性對(duì)照+1個(gè)陰性對(duì)照)配制反應(yīng)體系,具體配制方法如下:分別吸?。ǎ╪+2)×11.5μLGW反應(yīng)液+(n+2)×11.5μLGW預(yù)混液)加入潔凈離心管中,移液器吹吸充分混勻,分裝至PCR管中,每孔23μL,放在冰盒中備用。

2.2然后向反應(yīng)液中依次添加2μL陰性對(duì)照、提取的樣本核酸和GW陽性對(duì)照,蓋好管蓋,做好記錄,每個(gè)反應(yīng)總體積為25μL。充分混勻,離心10秒后在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

3.PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))

95℃預(yù)變性3分鐘;95℃變性10秒,58℃退火延伸30秒,35個(gè)循環(huán),在58℃時(shí)收集熒光信號(hào)。熒光第一通道選擇FAM(CHD-W基因),第二通道選擇VIC/HEX(內(nèi)源性內(nèi)參基因)(使用ABI系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,若有需求可提前聯(lián)系廠家或自行添加ROX校正染料;否則參照正常程序進(jìn)行)。

4.結(jié)果判定

4.1陽性對(duì)照FAM通道和VIC/HEX通道的Ct值均<28且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線,陰性對(duì)照無Ct值或Ct值≥35且無“S”型擴(kuò)增曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效;否則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn),如重測(cè)實(shí)驗(yàn)仍無效,請(qǐng)與廠家技術(shù)人員聯(lián)系。

4.2樣本VIC/HEX通道的Ct值應(yīng)≤30且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線,表明樣本提取和擴(kuò)增有效;如VIC/HEX通道無Ct值或Ct值為30<Ct≤35,表明樣本核酸提取不達(dá)標(biāo)或存在較強(qiáng)抑制干擾物(如酒精等消毒劑、抗凝劑等殘留)抑制擴(kuò)增,建議重新處理樣本進(jìn)行核酸提取及擴(kuò)增;

4.3樣本VIC/HEX通道檢測(cè)有效后,再進(jìn)行FAM通道的判定:

Ct值≤30且出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線,判定為CHD-W基因陽性,表明樣本來源于雌性;

Ct值為30<Ct<32,則均判定為可疑,建議進(jìn)行復(fù)測(cè)(建議先排除環(huán)境氣溶膠污染導(dǎo)致的“假陽性”結(jié)果,再重新進(jìn)行核酸提取及檢測(cè)),如排除氣溶膠污染后FAM通道復(fù)測(cè)Ct值<30,且有明顯的擴(kuò)增曲線,判定為CHD-W基因陽性,否則判定為陰性;

無Ct值或Ct值≥32且無“S”型擴(kuò)增曲線,判定為CHD-W基因陰性,表明樣本可能來源于雄性。

注意事項(xiàng):

1)為了防止污染,實(shí)驗(yàn)需要嚴(yán)格進(jìn)行分區(qū)操作,分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離,避免人為因素造成交叉污染。實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套,不同區(qū)域獨(dú)立使用工具,需更換手套和實(shí)驗(yàn)服。PCR結(jié)束后,切勿立即開蓋,充分冷卻后再開蓋取樣,最大程度避免氣溶膠污染。

2)試劑使用前要完全解凍,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。操作臺(tái)、離心機(jī)及移液器等儀器應(yīng)定期使用含氯消毒劑、消毒酒精、核酸污染清除劑或紫外燈進(jìn)行消毒。

3)檢測(cè)結(jié)果為陰性,并不完全代表為雄性,核酸樣本發(fā)生未知突變、質(zhì)量不合格、載量過低、存在較強(qiáng)干擾抑制物導(dǎo)致核酸提?。z測(cè))不成功亦會(huì)產(chǎn)生“陰性”結(jié)果。本試劑盒僅用于鴿中CHD-W基因的特異性擴(kuò)增,涉及的其他產(chǎn)品請(qǐng)?jiān)斣兩a(chǎn)廠家。

4)本品為一次性用品,試劑中的組分對(duì)于自然光較為敏感,分裝及保存時(shí)注意遮光,請(qǐng)勿反復(fù)凍融,僅供科學(xué)研究,不用于臨床診斷等其他用途。

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